从人肝细胞分离与培养，探索人肝细胞在研究中的作用

肝实质由两种不同的上皮细胞谱系组成——肝细胞和胆管细胞。它们在发育过程中起源于肝母细胞。人肝细胞是肝脏的主要细胞，在肝脏功能中发挥着至关重要的作用。人肝细胞是研究肝脏功能和疾病的金标准。这些细胞参与炎症和再生，而炎症和再生是肝脏病理生理学的核心过程。因此，体外培养原代肝细胞是肝脏研究的基础。然而，在体外环境中分离和维持这些细胞并非易事。本文将介绍提取和培养过程中遇到的挑战，以及克服这些挑战的策略。

人肝脏肝细胞

人类肝细胞通常呈片状排列于肝脏内。肝细胞的细胞质内含有丰富的细胞器。粗面内质网合成用于分泌的蛋白质，而滑面内质网则富含药物和胆固醇代谢所需的代谢酶。

它们的质膜具有极性，由两个功能不同的区域组成。基底外侧区域与侧方的相邻肝细胞接触，基底表面与血管接触。顶端区域形成胆小管，负责胆汁分泌。而基底外侧区域则负责物质运输。

由于靠近血管供应，营养物质和氧气的梯度分布形成了不同的肝细胞代谢区。另一方面，这些细胞在肝小叶内也分布于不同的解剖区域——中央小叶区、门静脉周围区和中带区——从而赋予每个区域的细胞独特的特征。

人类肝细胞的主要功能

细胞特性的这种多样性凸显了肝细胞在肝脏生理学中的重要作用。

• 胆汁合成：胆汁由电解质、胆盐、胆汁酸、水、胆固醇、胆红素等组成。肝细胞合成胆汁，并通过胆小管分泌，以促进脂质的消化和吸收。这些细胞的顶端区域对胆汁具有耐受性，并含有不同的转运蛋白和通道，用于将胆汁释放到胆小管中。
• 药物代谢：肝细胞含有细胞色素（CYP450、CYP3A4、CYP1 等），能够代谢进入体内的任何药物或毒素。该反应分为两个阶段。第一阶段通过氧化、水解和还原作用转化药物。第二阶段将第一阶段代谢产物与硫酸根和谷胱甘肽等基团结合，以提高其水溶性并促进其排泄。这些功能使得原代肝细胞在药理学药物筛选中得到广泛应用。
• 营养稳态：当血糖水平过低时，肝细胞会清除血液中的胰岛素。这些细胞还能通过网格蛋白介导的内吞作用摄取铁，并促进铁释放到血液循环中。此外，它们还能从血浆和乳糜微粒中吸收脂蛋白。
• 免疫调节：肝脏接收大量血液，因此容易受到各种病原体的侵害。肝细胞会激活先天免疫系统，导致炎症反应。当肝脏受损时，肝细胞会调节免疫系统，同时平衡修复和纤维化过程。
• 分离步骤：最初，肝细胞分离采用机械方法，导致细胞产量低。随着时间的推移，酶消化法取代了机械方法，显著提高了细胞产量。不久之后，Seglen 优化了分离流程，并引入了两步灌注法。该方法首先在肝脏内循环无钙缓冲液，对桥粒造成不可逆的结构损伤，从而破坏细胞间的连接。第二步则循环含钙胶原酶溶液，消化细胞与其细胞外基质（ECM）之间的相互作用。

由于组织样本比完整器官更容易获取，因此已开发出从样本中分离细胞的方案。这些小组织无法进行灌注，但通常采用类似的两步酶消化程序。考虑到组织体积小，其产量已达到最佳水平。然而，如果能够实现规模化生产，则可以增加用于下游应用的细胞数量，从而提供一种更简便、更经济高效的分离方法。

分离原代人肝细胞的方案

分离过程首先是将人类肝脏置于冰上运送至实验室。

• 灌注操作：灌注设备包括一台蠕动泵。操作开始前，先用缓冲液灌注套管，以确保泵和管路的最佳工作状态。操作首先切除一小块组织，并将4-5根套管连接到其血管上。夹闭其他血管以增强灌注效果。灌注的第一步是用不含钙的EGTA缓冲液循环灌注组织，以冲洗掉血液而不使其凝固。组织颜色变为浅黄色或棕色表明灌注完成。灌注的第二步是循环灌注胶原酶溶液。组织失去弹性或发生形变表明已完全消化。
• 分离步骤：将组织置于玻璃培养皿中，用冰冷的含血清培养基冲洗以终止消化。摇晃组织使细胞释放到培养基中。将细胞悬液依次通过不同尺寸的筛网过滤后，以50-75×g离心，得到细胞沉淀。将沉淀洗涤并重悬于培养基中，即可分离出原代肝细胞。
• 纯化：为进一步纯化，将细胞悬液置于密度梯度离心液上。离心后得到人肝细胞沉淀。用缓冲液洗涤沉淀，并将其重悬于培养基中进行培养，以获得纯化的细胞群。细胞的多边形形态和 CK18 表达可用于表征细胞。

最终产量取决于多种因素，包括消化时间、灌注速率、供体特征、肝脏样本等。

肝细胞培养的局限性

原代人肝细胞提取自切除的肝组织或不适合移植的健康肝脏。这限制了可用于分离过程的组织样本数量，因此凸显了肝细胞培养的重要性。然而，肝细胞的长期培养一直面临挑战，因为这些细胞容易分化为间充质谱系或去分化，导致其功能和极性丧失。

尽管HepaRG等细胞系使得长期培养和研究这些细胞成为可能，但它们并不能完全模拟原代人肝细胞的功能。因此，多项研究致力于标准化细胞分离流程，以最大限度地提高细胞产量和活力，并优化长期培养条件。

肝细胞培养

为了延长体外培养的原代肝细胞的寿命，研究人员尝试模拟细胞在体内的微环境。因此，体外培养中使用胶原蛋白包被的培养板，以促进细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用。富含层粘连蛋白的胶原蛋白凝胶（Matrigel）能使细胞形态更加圆润，并使其在更长时间内保持肝脏特异性功能。三明治培养法是在细胞层层叠加的基础上，在细胞上方再覆盖一层胶原蛋白。细胞上下两层包被的类型会影响细胞的特性。但该技术可以将细胞的体外寿命延长至4周以上。

未来展望

肝细胞是肝脏的关键功能单位，参与多种生理功能。它们是理想的体外肝脏研究平台。然而，肝细胞的分离和培养仍然是一项艰巨的任务。虽然分离方法已经标准化，但为了获得更高的产量，仍需要专业技术和精密的仪器设备。组织功能在体外培养中维持时间短也是一个重要的障碍。目前，尤其是在模拟组织微环境的三维培养方面，人们正致力于延长组织特性​​的维持时间。我们提供传代次数最低的人肝细胞，以提高研究的准确性。我们的团队确保每批细胞的纯度和活力，并保证其一致性，从而加快您的研究进程。

常见问题解答

问：什么是肝细胞？

肝细胞是肝脏的关键功能细胞。它们负责肝脏的重要功能，包括胆汁合成、药物代谢、营养稳态和免疫调节。

问：分离和培养原代人肝细胞存在哪些挑战？

从肝组织中分离原代人肝细胞受到组织来源的限制，且操作步骤复杂，例如需要酶消化。体外培养肝细胞也十分困难，因为肝细胞在培养过程中容易发生去分化或转化为其他细胞类型，从而丧失功能和极性。

问：肝细胞如何参与肝脏炎症和再生？

肝损伤期间，肝细胞会释放促炎介质，这些介质不仅激活免疫反应，还能调节修复和纤维化。它们不仅对损伤做出反应，还能影响免疫细胞，从而平衡炎症和愈合过程。

问：分离原代人肝细胞通常遵循哪些方案？

一种常用的技术是两步酶促灌注法。首先使用无钙缓冲液破坏细胞间连接，然后用含钙胶原酶溶液灌注，以分解细胞外基质成分，从而释放肝细胞。之后，通过过滤、离心和密度梯度离心纯化组织，获得用于培养的活性肝细胞。最佳产量取决于消化时间、灌注速率和供体肝脏样本的质量。

郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请第一时间联系我们修改或删除，多谢。